Estudio de la relación estructura-función de proteínas utilizando técnicas bioquímicas, biofísicas y de biología celular. En concreto, en los últimos años la investigación se ha dirigido hacia el estudio de las proteínas de la cubierta de los virus de las hepatitis B (HBV) y C (HCV), que tienen un papel fundamental en el proceso de reconocimiento de las partículas virales y, por consiguiente, en la posible prevención de las infecciones

Metodologías yTécnicas:
      Purificación de proteínas. Análisis de estructura primaria. Caracterización molecular y enzimática de proteínas. Análisis espectroscópicos (absorción-UV; dicroísmo circular; emisión de fluorescencia) de proteínas. Clonaje y expresión en levaduras y bacterias. Mutagénesis dirigida. Ingeniería de proteínas.

Virus de la Hepatitis B

Imagen obtenida de Scripps Research Institute

 El antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B (HBsAg) es la base de la actual vacuna contra la infección por HBV. Se trata de una estructura macromolecular compleja en forma de partículas lipoproteicas, cuyo componente mayoritario es la proteína S (small). Además, existen dos proteínas minoritarias que contienen la misma secuencia de S precedida de extensiones amino terminales (dominios preS1 y preS2), denominadas proteínas M (midlde, preS2+S) y L (large, preS1+preS2+S).

Imagen obtenida de Glebe, D. World J. Gastroenterol. (2007), 13: 22-38

Los estudios más recientes se han dirigido hacia la región preS, que ha sido directamente relacionada con la infectividad viral. Esta región hidrofílica ha sido producida en la bacteria Escherichia coli, tanto la secuencia completa (preS), como diversos mutantes de deleción, así como los dominios separados (preS1 y preS2). La obtención de estas proteínas en elevadas cantidades ha permitido caracterizar su interacción con sistemas modelo constituidos por vesículas de fosfolípidos. Aunque tanto preS1 como preS2 interaccionan con fosfolípidos ácidos, es la región preS1 la responsable de los efectos observados. Dentro de ésta, los estudios con los mutantes de deleción indican que el extremo amino terminal de preS1, subdominio que ha sido implicado en la interacción con el receptor, no es necesario para la agregación y desestabilización de vesículas.

            Diferentes estudios permiten concluir que los dominios preS de todos los hepadnavirus poseen propiedades similares y que pueden estar implicados en las primeras etapas de la infección. Por otro lado, el papel de la miristoilación de la Gly N-terminal en la función de los dominios preS se ha estudiado coexpresando los dominios preS y la enzima N-miristoiltransferasa de levadura.  La proteína miristoilada y reconstituida en vesículas de PC, no sólo es capaz de desestabilizar sistemas modelo de membrana, sino que también se ha comprobado que penetra en hepatocitos de pato de forma totalmente específica. Por ello, se puede concluir que el dominio preS contiene toda la información necesaria para interaccionar con el receptor y penetrar en la célula vía endocitosis. Actualmente se está utilizando este sistema modelo para elucidar el mecanismo de fusión y liberación del contenido viral en el hepatocito.

Virus de la Hepatitis C 

El genoma del virus de la hepatitis C (HCV) codifica dos proteínas de la envoltura, E1 y E2, que deben ser las responsables de la unión y entrada del virus en los hepatocitos. Por tanto, constituyen los principales candidatos para la elaboración de una vacuna contra la infección por HCV. Estudiando aspectos que en la actualidad son prácticamente desconocidos, como son la estructura y la relación estructura-función de las proteínas E1 y E2, nuestro objetivo es contribuir a comprender la biología molecular de la hepatitis C.

   Imagen obtenida de Louis E. Henderson (Frederick Cancer Research Center).

1. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE DIFERENTES FORMAS RECOMBINANTES DE E1 Y E2

 Tras los distintos intentos de obtención de diferentes formas de E1 y E2 en sistemas de expresión tales como la bacteria E.coli, o la levadura metilotróficaPichia pastoris, que han resultado insatisfactorios, en la actualidad esta producción se lleva a cabo utilizando el sistema de expresión de baculovirus-células de insecto.

Sitios de glicosilación potenciales E1 y E2. Los sitios de glicosilación han sido identificados mediante la búsqueda de la secuencia consenso de N-Glicosilación en todas las secuencias de E1 y E2 disponibles en la base de datos EMBL. Los números superiores corresponden a las posiciones de los sitios de glicosilación. En la parte inferior se indican los porcentajes de conservación. Los dominios transmembrana de ambas proteínas aparecen en negro. (Tesis J. Daniel Tello).

Utilizando este sistema se ha obtenido la proteína E2(661), que comprende los aminoácidos 384-661 y a la que le falta la región transmembrana. Distintos estudios indican que E2(661) recombinante está correctamente plegada y es capaz de reconocer los anticuerpos de pacientes infectados por HCV. Además, E2(661) es capaz de interaccionar con vesículas de fosfolípidos ácidos tanto a pH neutro como ácido, produciendo la desestabilización de estos sistemas modelo de membrana.

Por otro lado, y también utilizando baculovirus recombinantes, se ha conseguido clonar y expresar proteínas de fusión en las que se encuentran los ectodominios de E1 y E2 completos, tanto en su orden natural (E1E2), como con las proteínas permutadas (E2E1).  La caracterización estructural y funcional de estas construcciones ha permitido concluir que los ectodominios de las glicoproteínas del HCV, E1 y E2, están plegados en las proteínas recombinantes de una forma similar a como se encuentran en la superficie del virus. Además, las formas quiméricas estudiadas son funcionales, presentando tanto actividad fusogénica como capacidad para interaccionar con los receptores celulares implicados en la entrada del virus. Por todo ello, estas proteínas quiméricas resultan ser un modelo ideal para el estudio de las primeras etapas del ciclo infectivo del HCV, y podrían serlo también para el desarrollo de una vacuna basada en los ectodominios de E1 y E2.

2. ESTUDIO DEL MECANISMO DE ENTRADA DEL VIRUS DE HEPATITIS C EN LA CÉLULA 

Hay estudios que indican que los heterodímeros no covalentes E1E2 juegan un papel en la entrada del HCV en la célula; en concreto, E2 parece ser la proteína implicada en la interacción con los receptores del virus. Junto al papel que juegan en la unión a un posible receptor celular, las proteínas de la cubierta viral E1 y E2 deben inducir la fusión de las membranas viral y celular. Todas las proteínas recombinantes obtenidas en el sistema de baculovirus son capaces de interaccionar a nivel de la membrana plasmática con células de origen hepático (Huh-7, Hep G2, Hep3B). La interacción se produce mediante la unión a los receptores de membrana CD81 y SR-BI. Una vez se ha producido dicha interacción, las proteínas recombinantes son internadas mediante diversos mecanismos que implican el citoesqueleto de actina y vesículas revestidas de clatrina. Parte de la proteína internada tiene como destino los endosomas tempranos, aunque también se puede presentar en lisosomas, donde probablemente es degradada. En la actualidad se continúa con el estudio y la caracterización de los posibles mecanismos de endocitosis del HCV mediante el uso de diferentes técnicas bioquímicas y de biología celular.